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제한 효소 실험

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고등학교 생명과학실험 ⑨ – 플라스미드 DNA 제한효소처리 실험

<실험에 사용한 제한효소>

이번 실험에는 HinD III와 BamH I이라는 매우 흔하고 유명한 제한효소를 사용했다.

HinD III 제한효소는 Haemophilus influenzae 로부터 추출한 제한효소로 마그네슘 이온이 존재할 때 5’-AAGCTT-3’를 인식하여 A와 A 사이를 자른다. 보조 인자인 마그네슘 이온은 물과 결합하여 효소의 활성 부위로 운반하는 역할을 한다. BamH I 제한효소는 Bacillus amyloliquefaciens 로부터 추출한 제한효소로 5’-GGATCC-3’를 인식하여 G와 G 사이를 자른다. 제한 효소 처리 실험을 할 때 HinD III와 BamH I은 서로 방해할 수 있는 효소이기 때문에 따로 처리해야 한다. HinD III는 80도에서 불활성화되고, BamH I은 온도 변화로 불활성화되지 않기 때문에 본 실험에서는 HinD III 제한효소를 먼저 처리할 것이다.

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<실험에 사용한 플라스미드 벡터>

실험에 사용하는 플라스미드 벡터는 pFLAG-CMV-2로 복제원점과 프로모터를 가지고 있지만, 대장균에서 DNA 복제가 가능하도록 SV40 ori를 삽입하고, RNA 중합효소와 친화도를 높여 인위적인 발현을 높이기 위해 CMV promoter를 삽입한 플라스미드이다. AmpR (ampicillin resistance gene)은 항생제 저항 유전자로 screening을 통해 형질전환이 제대로 된 대장균을 걸러낼 때 쓰인다. FLAG-tag는 폴리펩타이드 서열로 아스파르트산, 타이로신, 리신으로 이루어진 DYKDDDDK 서열을 의미한다. 이 서열이 발현된 플라스미드를 pFLAG 라고 부르며, 항체 형성에 관여해서 외부 항원이 인식할 수 있다. 항체와 친화도를 높여준다. CMV promoter는 CMV(cytomegalovirus)의 프로모터로 플라스미드 벡터에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있다.

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HinD III와 BamH I 인식 자리에 재조합 DNA 기술로 SHP2 유전자를 넣어서 CMV2–Flag-SHP2-WT-MYC 플라스미드를 만들었다. 플라스미드에 목표 유전자를 넣으면 플라스미드를 벡터로 이용해서 대장균을 형질 전환시킬 수 있다.

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CMV2–Flag-SHP2-WT-MYC

CMV2 벡터 – Flag tag 단백질 표시가 있는 – SHP2 단백질을 만드는 목적 유전자를 첨가한 – WT 야생형 – MYC 제한효소 절편자리.

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Ezbuffer II는 HinD III와 BamH I 효소가 동시에 100%로 작용할 수 있는 완충제이다. 내용물에는 pH를 약염기로 만들어주는 Tris-HCl과 NaCl이 있으며, MgCl2는 보조 인자로 사용되고, BSA는 반응의 빠르기와 용액의 휘발성을 높여준다.

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2. 실험 재료

분자생물학실험 | 제한효소 처리 및 Agarose gel에서 DNA 회수

TIP 본 실험에서는 플라스미드 DNA를 이용한 제한효소처리를 통하여, 이론적으로만 배웠던 제한효소의 반응원리를 실제로 수행하였다. 이를 통해 서로 다른 제한효소의 특성을 이해하고, 제한효소 반응 시 고려해야 할 점을 알아보았다. 그리고 Agarose gel 전기영동 결과를 관찰해 봄으로서 절단된 DNA 조각들의 크기를 알아보고 제한효소 처리가 잘 되었는지 확인해보았다. 또한 DNA 분자에서 여러 제한효소의 인식염기서열의 상대적인 위치를 알 수 있으므로 제한효소 지도를 작성해 보고자 한다.

유전자 클로닝이나 재조합, DNA의 생화학적 연구, 유전자의 구조 연구나 유전자의 발현 조절 연구의 기본이 되는 유전자 조작 기술에는 DNA의 절단과 연결, DNA 증폭이나 RNA 합성 또는 특별한 작용기의 첨가와 제거가 매우 중요하다. 이러한 DNA의 조작 기술에는 고도로 정제된 여러 효소를 이용하게 되며, 가장 기본이 되는 유전자의 절단과 연결에는 제한효소(restriction enzyme)와 라이게이즈(ligase)가 필수적이다.

이와 더불어 DNA를 합성하는 중합효소 등 유전자를 조작하는 많은 효소도 유전자 조작 기술에 필요한데, 이들은 촉매반응의 종류에 따라 여러 종류로 나누어진다. 핵산분해효소(nuclease)는 핵산 분자를 절단하거나 또는 짧게 만드는 효소이다. 핵산분해효소는 핵산의 골격을 형성하는 인산다이에스터 결합(phosphodiester bond)을 절단함으로써 핵산을 분해한다. 핵산분해효소는 작용 방법에 따라 크게 핵산말단분해효소(exonuclease)와 핵산내부분해효소(endonuclease)로 구분하며, 작용하는 대상에 따라 DNA 분해효소(DNase)와 RNA 분해효소(RNase)로 구분된다.

특정한 유전자를 분리하는 데 필요한 것은 염색체를 일정 부위로 절단하는 기술이고, 이러한 목적에 사용되는 것이 제한효소이다. 제한효소는 박테리아 세포에 원래부터 존재하는 효소로, 외부로부터 들어오는 외래 DNA을 제거하여 자신의 유전체를 보호하는 기능을 한다. 제한효소는 외래 DNA를 제한(restriction)하고 핵산의 내부를 절단하는 효소(endonuclease)이므로 restriction endonuclease라고 한다. 제한효소의 명칭은 각 제한효소가 분리된 박테리아의 이름에서 유래한다. 즉 Escherichia coli R strain으로부터 분리한 제한효소이고 그 박테리아에서 처음 분리된 효소인 경우에는 EcoRⅠ이라 명칭한다.

제한효소는 4～9개의 특수한 염기서열을 인식하여 그 염기서열 부분을 절단하는 특성이 있다. 예를 들어 EcoRⅠ은 GAATTC라는 6개의 염기서열을 인식하고 절단한다. 이 염기서열이 외부에서 침략한 DNA에 존재하면 그 부위를 절단해 버린다. 따라서 제한효소가 인지하는 염기서열의 수에 따라 제한효소를 4염기 절단자(4-base cutter) 혹은 6염기 절단자(6-base cutter) 등으로 구분할 수 있다. 한편 제한효소에 의해 절단된 DNA 부위의 생긴 모양에 따라 점착성 말단(sticky end)과 비점착성 말단(blunt end)으로 나눌 수 있다.

제한효소는 DNA의 절단 방식에 따라 Ⅰ형과 Ⅱ형 그리고 Ⅲ형 등 세 가지 형으로 나눈다. Ⅰ형은 인식 염기서열과 절단 부위가 다른데, 보통 절단 부위는 인식 염기서열로부터 약 1,000bp 정도 떨어진 곳에 존재하며, 절단되는 염기서열도 일정하지 않다. Ⅲ형 역시 인식 부위와 절단 부위가 서로 다르며, Ⅰ형과 마찬가지로 5～7bp 길이의 비대칭적 염기서열을 인식하는데, 절단 부위는 인식부위의 약 24～26bp 아래쪽(downstream)에 위치한다. Ⅰ형과 Ⅲ형 제한효소는 이것에 의해 절단된 DNA의 정확한 염기서열을 알기 어려우므로 유전자 조작에 있어 거의 이용되지 않는다.

반면에 Ⅱ형 제한효소는 DNA상의 특정한 인식 염기서열에서 DNA를 절단하므로 유전자 조작에 아주 중요하게 사용되는데, 흔히 제한효소라고 하는 것은 Ⅱ형 제한효소를 의미한다. 박테리아는 감염된 박테리오파지 DNA가 숙주세포 내에서 복제되어 새로운 파지 입자를 합성하기 전에 파지 DNA를 절단하는 효소를 생성하여 파지의 번식을 제한한다. 박테리아에서 침입한 바이러스의 DNA는 제한작용으로 파괴되지만 자신의 DNA는 효소로부터 보호된다. 그 이유는 박테리아 자신의 DNA에 메틸기가 붙게 하여(메틸화, methylation) 자신의 효소가 바이러스 DNA만을 인식해서 분해하는 반면 자신의 DNA는 효소가 절단하지 못하도록 하기 때문이다.

제한효소를 처리할 때는 그 제한효소가 작용할 수 있는 buffer와 함께 처리해야 하며, 그 제한효소가 작용할 수 있는 온도(대개 37℃, 간혹 25℃)에서 반응시켜야 한다. 제한효소의 양을 나타내는 단위인 1U(unit)는 1㎍의 DNA를 1시간 안에 절단할 수 있는 양의 제한효소를 일컫는다.

제한효소에 의해 절단된 DNA 단편의 수와 크기를 측정하면 DNA 분자에서 여러 제한효소의 인식염기서열의 상대적인 위치를 알 수 있다. 제한효소 절단 부위를 DNA상에 표시할 수 있는데, 이렇게 DNA상의 여러 다른 제한효소 자리의 위치를 나타낸 지도를 제한효소 지도(restriction enzyme map)라고 한다.

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실험 방법

1. 제한효소에 의한 절단

1) 본 실험에서는 pGMTH1을 사용하였는데, 이것은 pGEM에 우리가 원하는 TH1 유전자를 EcoRⅠ과 HindⅢ를 이용하여 삽입한 것이다. 미리 준비된 DNA에 EcoRⅠ과 HindⅢ, 그리고 RNase를 이용하여 4가지 방법으로 처리하였다.

2) EcoRⅠ과 HindⅢ으로 싱글 컷을 한 후 RNase처리를 하거나 하지 않는 경우, EcoRⅠ과 HindⅢ으로 더블 컷을 한 후 RNase처리를 하거나 하지 않는 경우로 나누었다.

3) 사용한 제한효소들은 Promega사에서 구입한 것인데, 이 때 가장 정확히 실험할 수 있는 상태로 제조된 buffer도 같이 판매하여서 이것을 같이 사용하였다.

4) buffer system은 A, B, C, D, H 등으로 구분되어 있어서 해당 제한효소에 따라 각각 다른 버퍼를 사용하도록 되어 있다. EcoRⅠ과 HindⅢ에는 각각 H와 E buffer를 사용해야 했다.

5) 더블 컷의 경우에는 멀티코어 버퍼를 사용했다. RNase는 파우더 형식으로 되어 있어서 물에 녹여서 사용한다.

6) 제한 효소에 체온이 전달되면 활성 될 수 있음에 제한 효소 처리 시에 제한 효소가 없는 tube상층부를 잡고 첨가 하여야하고, 항상 영하 20℃에서 보관하여야 한다. 나는 EcoRⅠ과 HindⅢ로 더블 컷을 하고 RNase를 처리하지 않는 경우를 수행했다.

7) 실험에서 EcoRⅠ은 12U/㎕, HindⅢ은 10U/㎕, RNase은 10U/㎕로 사용하였는데, 이는 제한된 시간 내에 모두 반응을 시키기 위해서 많이 사용한 것이다. 튜브 벽에 있는 용액을 모두 내려오게 하기 위해 원심분리를 시킨 후 37℃의 인큐베이터 안에서 1시간 동안 반응시켰다. 효소는 20～25℃정도의 상온에서보다 37℃에서 높은 활성을 나타내기 때문이다.

2. 젤 전기영동에 의한 분리

다음으로 젤 전기영동을 실시하였다.

0.8% Agarose gel 50㎖를 준비한 후, 준비된 시료에 loading dye 5㎕를 섞어주어 20㎕만을 로딩하였다. 전기영동은 이온 교환 크로마토그래피와 같이 혼합물에서 분자를 분리하기 위해 전기적 전하의 차이를 이용하는 기술이다.

DNA 분자는 음전하를 띄고 있기 때문에 전기장에 놓일 때 양극(+)쪽으로 이동한다. 제한 절단으로 DNA 단편이 생기며, 그 크기는 처음 분자의 효소에 대한 인식 염기배열의 정확한 위치에 따라 다르다.

만약 제한효소들이 유전자 클로닝에 사용된다면 이러한 단편의 수와 크기를 결정하는 방법이 명백하게 필요하다. DNA 분자가 절단되는지 아닌지는 용액의 점도를 측정함으로써 쉽게 결정할 수 있다. 큰 DNA 분자는 작은 것보다 점도가 높은 용액이 되므로 절단은 점도를 감소시키는 결과를 가져온다.

그렇지만, 각각의 절단 생성물의 수와 크기를 안다는 것은 매우 어렵다. 이 문제점은 젤 전기영동(gel electrophoresis)기술이 개발된 1970년대 초에 궁극적으로 해결되었다. 전기영동을 젤에서 시킬 때는 DNA 분자의 크기도 하나의 인자가 된다.

일반적으로 아가로스, 폴리아크릴아마이드, 혹은 이 두 가지 혼합물로 만들어진 젤은 복잡한 기공망을 함유하며, 이것을 통해 DNA 분자가 양전극으로 향해 이동한다. DNA 분자가 작을수록 젤을 통해 빨리 이동한다. 그러므로, 젤 전기영동은 DNA분자를 크기에 따라 분리시킨다.

그리드형

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